En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas, pero obligadamente en
suspensión celular y en forma de
célula única. Se las obliga a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, a modo de una delgada corriente de la suspensión celular. Cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como consecuencia de la excitación láser a la que es sometida. Los parámetros que típicamente se miden de forma simultánea por cada célula son:
1. Dispersión frontal de la luz a 2º (forward scatter), valor proporcional al tamaño celular.
2. Dispersión de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de estructuras granulares o complejidad de la célula.
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.
La
dispersión de la luz por si sola resulta ser de bastante utilidad. Comúnmente se utiliza en la exclusión de las células muertas, agregados celulares, restos celulares, así como para reducir el ruido de fondo en la medición de la fluorescencia. Es suficiente para discriminar linfocitos de monocitos y granulocitos en muestras leucocitarias hemolisadas. La dispersión de la luz también puede utilizarse en la cuantificación de la agregación de las células vivas.
Convencionalmente, las
intensidades de fluorescencia se miden a diferentes longitudes de onda y de manera simultánea para cada una de las células. A fin de medir los componentes de interés de cada una de las células, pueden ser utilizadas diversas sondas fluorescentes. Los anticuerpos conjugados a fluorocromos son utilizados muy a menudo en la cuantificación de la densidad antigénica de determinados marcadores, y distinguir subpoblaciones de tipos celulares diferenciados, incluso aquellas células con expresión de transgenes.
Mediante
técnica de conjugación a fluorocromos, pueden realizarse mediciones de la unión de virus u hormonas a sus correspondientes receptores de superficie. También pueden analizarse componentes intracelulares mediante sondas fluorescentes específicas, como por ejemplo el contenido celular de ADN (permitiendo estudios de ciclo celular y ploidía), el ADN sintetizado de novo, secuencias nucleotídicas específicas, ARNm, filamentos de actina, y en definitiva cualquier estructura para la que exista un anticuerpo o una sonda fluorescente disponible. La citometría de flujo puede utilizarse además en la monitorización de cambios en el calcio intracelular, del potencial de membrana, el pH, o en el contenido de ácidos grasos.
Los
citómetros de flujo consisten de complejos sistemas fluídicos, óptica láser, detectores electrónicos, convertidores analógico-digitales y digitales, y ordenadores. Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente. El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células, y en los separadores celulares o "cell sorters", se produce una rotura del flujo en gotas de tamaño uniforme para conseguir la separación de células individuales. El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el control del ordenador, se consigue la carga electrónica de las gotas que contienen las células de interés para poder someterlas a deflección y recogerlas en tubos específicos para tal fin, o sobre pocillos de cultivo de tejidos. El ordenador permite almacenar datos de miles de células por cada muestra, y representar los resultados gráficamente.
